檢測方法
利用酶聯(lián)免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測定。
檢測原理
酶聯(lián)免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進行免疫測定。先將三聚氰胺酶標(biāo)記物，樣品萃取物及標(biāo)準(zhǔn)加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競爭結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。在用去離子水清洗結(jié)束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍色的物質(zhì)。孵育30分鐘后停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。
實驗所需設(shè)備及材料
三聚氰胺檢測試劑盒（目前常用進口試劑有美國Abraxis公司和美國Beacon公司的）
酶標(biāo)儀一臺（配有450nm濾光片）
1－5ml可調(diào)移液器
100－1000ul可調(diào)移液器.
20－200ul可調(diào)移液器.
蒸餾水或去離子水..
可吸取50ul的移液器及吸頭.
可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭.
吸水紙或相當(dāng)?shù)奈牧?
450nm的酶標(biāo)儀.
計時器.
洗瓶
混旋器.
20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.
注意事項
最好配套使用試劑，不要同其它公司的產(chǎn)品混用，不要將不同批次的產(chǎn)品混用。
樣品稀釋或含有雜質(zhì)很可能對結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。
不要使用過期的產(chǎn)品。
使用之前將所有試劑回升至室溫，但不要放置超過24小時。
三聚氰胺屬于有毒性的化學(xué)品，請小心處理。
停止液是1N鹽酸，避免接觸皮膚。
樣品制備 （以美國Beacon試劑為例）
濕的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：100）
均質(zhì)樣品至布丁狀。
稱取2g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩。
超聲萃取1分鐘。
漩渦混合1分鐘，然后靜置5分鐘，使樣品分層。
3000 g 室溫離心5分鐘。
用玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。
用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
移取150 ul 進行分析。
注意：用此方法測定了8個添加有15ppm三聚氰胺的貓糧（非要求召回），回收率范圍為75%-117%。
本方法只可作為樣品篩選方法，不可作為最終確認方法。
小麥面筋蛋白萃取方法：（稀釋倍數(shù)：500）
1.均質(zhì)或混勻小麥面筋蛋白樣品。
2.稱取0.2g均質(zhì)好的樣品加入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。
3.漩渦混合并超聲萃取，使樣品溶解（確保樣品中沒有結(jié)塊）。
4.用樣品稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）。
5.10000轉(zhuǎn)/分離心上清液10分鐘。
6.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。
7.移取150 ul 進行分析。
注意：如果樣品中含有大量的添加物，需要加入更大量的萃取溶液，以保證萃取效率。
操作人依據(jù)自己的判斷力，如果測試結(jié)果比較高，需要加入兩倍的萃取溶液（0.2/20mL），進行二次測定。
干的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：200）
1.質(zhì)器均質(zhì)干的寵物飼料樣品。
2.稱取1g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩。
3.超聲萃取1分鐘。漩渦混合1分鐘，然后靜置5分鐘，使樣品分層。
4.3000 g 室溫離心5分鐘。
5.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。
6.用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
7.移取150 ul 進行分析。
免疫測定過程 (注意: 標(biāo)準(zhǔn)及樣品最好做平行試驗以增加準(zhǔn)確度)
將所有試劑及樣品回升至室溫20-280C，但不要放置超過24小時。
從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮
吸取150ul標(biāo)準(zhǔn)、樣品到對應(yīng)微孔中，必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取，避免交叉污染。 加入50ul三聚氰胺酶標(biāo)記溶液到每個小孔中。
混合60秒，20-28攝氏度下孵育30分鐘。
將微孔中的溶液倒入水槽中，用蒸餾水完全充滿微孔，震蕩后倒掉，重復(fù)三次，總共四次洗板。
在吸水紙上拍打，盡可能將水拍干。
每個微孔中加入100ul底物溶液。
20-28攝氏度下，孵育30分鐘。
每個微孔中加入100ul停止液。
450nm下讀板。
結(jié)果分析
半定量的結(jié)果是由樣品的吸光率與標(biāo)準(zhǔn)的吸光率的簡單對比而來判定:樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色淺則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度高, 樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色深則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度低。
定量分析需要繪制以標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光率為X軸,以標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度的半對數(shù)為Y軸的曲線圖.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣吸光率的點畫成一直線,如此樣品的光吸收率可在線上找到,與此相對應(yīng)的Y軸則為樣品的濃度,樣品光吸收率范圍應(yīng)比標(biāo)準(zhǔn)樣的最底范圍高,比最高范圍低, 即可說明此樣品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb。